Оценка состава микробиома с помощью ДНК-секвенирования: 16S рРНК vs WGS
Что революционного в методах ДНК-анализа микробиома? Ведь есть классические технологии бактериального посева, когда образец биоматериала наносится на чашку Петри на питательную среду.
Качественно - о наличии или отсутствии того или иного рода бактерий - судят по наличию колоний бактерий. Заодно проводится и количественная оценка присутствия - через подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ).
Однако, такой метод не сработает для видов, которые плохо поддаются культивации. Конечно, за последние годы развились технологии культуромики, которые позволяют путем подбора специальных сред и условий (в том числе анаэробных) “вытянуть” из образца существенное таксономическое разнообразие. Но такой подход пока что достаточно сложный и дорогостоящий.
Зато ДНК-секвенирование микробиома дает представление о полном составе микробиома - благодаря тому, что выделяется и прочитывается генетический материал от всех бактерий - как культивируемых, так и некультивируемых. В настоящий момент большая часть микробиомного секвенирования в мире проводится в двух форматах - ампликонном и полногеномном.
Ампликонное - это когда амплифицируется и читается лишь один ген из каждой бактерии - благодаря универсальной паре праймеров. В 99% случаев для бактерий и архей берется ген 16S рРНК - точнее, какой-то из его участков. Поэтому часто такой формат называют 16S рРНК секвенирование (16S rRNA sequencing).
А при полногеномном секвенировании (WGS, от англ. whole-genome sequencing - также называемом shotgun sequencing) - читается не какой-то отдельный ген от каждой бактерии, а вся совокупность ДНК. Сюда входят не только все генетические последовательности от бактерий, но также и микроскопических грибков, водорослей, ДНК организма хозяина, всевозможных вирусов - словом, проводится тотальный анализ.
Преимущества полногеномного анализа - в том, что он более детальный - позволяет определять не только таксономический состав микробного сообщества (как 16S рРНК), но и генный состав наиболее представленных бактерий, вплоть до отдельных генов и полиморфизмов в них. Однако, он в то же время существенно дороже, чем ампликонное секвенирование 16S.
Выбор метода - 16S или WGS - следует проводить на стадии разработки схемы исследования. За одну и ту же сумму вы сможете обработать больше образцов с помощью WGS (но сможете реконструировать геномы бактерий из данных!) - либо больше образцов в формате 16S. В последнем случае, хотя детальность анализа будет ограничена таксономическим составом на уровне рода или вида, вы сможете увеличить статическую мощность и таким образом получите возможность корректно проверить гипотезы вашего клинического исследования - например, влияет ли прием пребиотика на микробиом или отличаются ли пациенты с каким-либо заболеванием от здоровых людей.
С учетом масштабов типичного микробиомного клинического исследования, выбор обычно склоняется в пользу анализа порядка сотен образцов с помощью 16S рРНК секвенирования, нежели десятков - с помощью WGS.